無色活體標(biāo)本借助生物顯微鏡。不同的顯微技術(shù)旨在改變相移光與試樣的相互作用將試樣轉(zhuǎn)化為振幅偏移人眼可見的亮度差異。

活體樣本可視化的挑戰(zhàn)

明視野顯微鏡通常只能提供未染色標(biāo)本的微弱圖像，其中只能檢測(cè)到一些細(xì)節(jié)。要在圖像中看到更多細(xì)節(jié)，增強(qiáng)對(duì)比度非常重要。增強(qiáng)對(duì)比度的一種方法是對(duì)樣本進(jìn)行染色。然而，這對(duì)生物體來說是不可能的，因此它們不會(huì)著色，看起來也不明顯。實(shí)際上，這些樣本也會(huì)與光學(xué)顯微鏡中的入射光發(fā)生相互作用。然而，所發(fā)生的相移是人眼無法察覺的。眼睛只能感受到振幅（亮度）和頻率（顏色）的變化。

對(duì)比度是指區(qū)分樣品和背景以及發(fā)現(xiàn)樣品細(xì)節(jié)的可能性。對(duì)比度的定義是圖像和相鄰背景之間的光強(qiáng)與整體背景光強(qiáng)之間的差異。對(duì)于人眼來說，這些差異至少要達(dá)到百分之二才能被檢測(cè)到。使用光電探測(cè)器可以大大提高對(duì)比度。

然而，對(duì)比度不僅取決于樣本及其與光的相互作用本身。用于觀察樣本的光學(xué)系統(tǒng)及其記錄圖像信息的能力也至關(guān)重要。在顯微系統(tǒng)中，對(duì)比度取決于正確的光圈設(shè)置、光學(xué)像差的等級(jí)、使用的對(duì)比度方法、標(biāo)本和探測(cè)器。

因此，通過改變光闌的光圈設(shè)置，光學(xué)顯微鏡所獲得圖像的對(duì)比度可以不受對(duì)比度方法的影響。但是，如果聚光鏡等縮小得太多，分辨率就會(huì)受到影響，并可能出現(xiàn)衍射偽影。

要獲得足夠的對(duì)比度，最古老的方法可能是先對(duì)樣品進(jìn)行染色。通常情況下，這只適用于死物，有時(shí)還需要一些復(fù)雜的染色方案。如果要觀察活細(xì)胞，染色就不容易做到。因此，不同的技術(shù)（由適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)顯微鏡提供）旨在將光與樣本相互作用產(chǎn)生的相移轉(zhuǎn)變?yōu)榉啤?/span>

相位對(duì)比和微分干涉對(duì)比（DIC ）就是這些對(duì)比方法的例子。其他光學(xué)對(duì)比方法還有暗場(chǎng)對(duì)比和偏振對(duì)比。

圖 1：振幅對(duì)象和相位對(duì)象。上排：當(dāng)光線穿過所謂的振幅物體（紅框）時(shí)，光波的振幅（A）會(huì)降低（ΔA）。人眼會(huì)感覺到亮度降低。中間一行：在所謂的相位物體中，光線通過物體時(shí)會(huì)導(dǎo)致光波的相位移動(dòng) (Δj)，人眼無法察覺。下排：未發(fā)生變化的光波。

光與樣本之間的相互作用

如果入射光照射到試樣上，它們就會(huì)發(fā)生相互作用。吸收、反射、衍射、光散射和折射都是可能的結(jié)果。在此過程中，入射光波會(huì)發(fā)生變化。相位移動(dòng)和振幅變化都是可能的。在這方面，我們可以區(qū)分相位物體和振幅物體。在理想情況下，相位對(duì)象是改變光波相位而非振幅的樣本。相反，振幅對(duì)象只影響光的振幅而不影響光的相位。對(duì)于可見光而言，扁平和未染色細(xì)胞幾乎達(dá)到了相位對(duì)象的特征。由于它們只是導(dǎo)致人眼無法看到的相位偏移，因此在明視野顯微鏡下的對(duì)比度非常低。振幅物體本身在明視野顯微鏡中的成像效果非常好。它們會(huì)降低振幅，從而降低通過光的強(qiáng)度。染色或自然著色的物體可以在明視野中很好地顯示出來。它們屬于振幅物體。它們會(huì)減弱通過的光線，從而減小波面的振幅。但它們并不是理想的振幅物體。除了振幅之外，它們還會(huì)影響入射光的成分。它們會(huì)吸收或反射特定頻率的光波，而其他波長的光則可以不受阻礙地通過。由于試樣和周圍介質(zhì)的折射率不同，會(huì)產(chǎn)生相移。如果光波進(jìn)入細(xì)胞，它會(huì)準(zhǔn)減速，而振幅保持不變。當(dāng)光波離開細(xì)胞時(shí)，它會(huì)恢復(fù)速度，并以與之前相同的頻率、波長和振幅穿過介質(zhì)。然而，與只穿過介質(zhì)的光相比，它的相位發(fā)生了偏移。由于人眼和其他光學(xué)檢測(cè)器無法識(shí)別和檢測(cè)光波的相位變化，因此在未染色和未著色的標(biāo)本中，對(duì)比方法的主要目的是產(chǎn)生振幅對(duì)比，并將相位對(duì)比轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹鶎?duì)比。

圖 2a：兔味蕾切片，相襯顯微鏡

圖 2b：兔味蕾切片，微分干涉對(duì)比顯微鏡

圖 2c：兔味蕾切片，明視野顯微鏡

對(duì)生物研究產(chǎn)生巨大影響

與使用固定和染色的物體相比，使用未染色標(biāo)本具有許多優(yōu)勢(shì)。它允許在生物顯微鏡下觀察活體，沒有固定和染色的人工痕跡。例如，固定和染色會(huì)使標(biāo)本收縮或膨脹。此外，還有可能破壞細(xì)胞中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)或嚴(yán)重改變其形態(tài)。消除這種危險(xiǎn)的可靠方法就是使用活體樣本，因?yàn)榛铙w樣本沒有偽影，能提供可靠、真實(shí)的信息。

活細(xì)胞顯微鏡的另一大優(yōu)勢(shì)是可以檢查隨時(shí)間變化的情況。除了獲得細(xì)胞的靜態(tài)信息和情況快照外，還可以隨時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)過程，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡。由于這些過程有時(shí)會(huì)耗費(fèi)大量時(shí)間，因此最好在光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)中添加一個(gè)攝像頭，以記錄延時(shí)影片。

不同的光學(xué)對(duì)比方法所獲得的信息和印象因其來源而異。因此，建議結(jié)合使用不同的對(duì)比技術(shù)，以獲得最準(zhǔn)確、最詳細(xì)的受檢樣本圖像。明視野通常無法準(zhǔn)確觀察細(xì)胞的形態(tài)，而其他光學(xué)對(duì)比方法則可以提供更多信息。

在活細(xì)胞圖像中添加熒光標(biāo)記可獲得更多信息。可以用 GFP 等熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)。然后就可以通過光鏡圖像追蹤并準(zhǔn)確確定其在細(xì)胞內(nèi)的定位。此外，還可以將 GFP 與多肽定位信號(hào)結(jié)合起來。通過這種方法，像內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這樣的獨(dú)特區(qū)塊就可以被可視化。

研究中使用的現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡通常采用模塊化設(shè)計(jì)，可以在各種對(duì)比方法之間快速切換，甚至可以同時(shí)使用。光學(xué)對(duì)比方法為在實(shí)驗(yàn)室日常工作中輕松檢查活體和無色標(biāo)本提供了可能。

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